Giáo trình công nghệ sinh học thực vật

Cụ thể, tập tin bao gồm:

• Tổng quan về Công nghệ DNA tái tổ hợp: Định nghĩa, ý nghĩa của việc tạo dòng DNA, các bước cơ bản trong thí nghiệm tạo dòng DNA (tinh sạch DNA, cắt DNA, xác định kích thước, đưa vào vector, đưa vào tế bào chủ, xác định tế bào chủ chứa DNA tái tổ hợp).
• Các enzyme tác động lên DNA: Phân loại và chức năng của 5 nhóm enzyme chính: Nuclease (cắt, phân giải nucleic acid), Ligase (nối các phân tử nucleic acid), Polymerase (tạo bản sao), các enzyme biến đổi (tách/gắn nhóm hóa học), và Topoisomerase (thay đổi cấu trúc xoắn của DNA vòng). Đặc biệt nhấn mạnh vai trò của enzyme hạn chế (restriction endonuclease) trong việc cắt DNA ở các vị trí xác định.
• Enzyme hạn chế (Restriction Endonuclease): Lịch sử phát hiện, cơ chế hoạt động (loại II cắt ở trình tự xác định), khái niệm đầu bằng và đầu dính (sticky ends), số lượng vị trí nhận biết trong phân tử DNA và quy trình cắt trong phòng thí nghiệm.
• Phân tích kết quả cắt bằng enzyme hạn chế: Giải thích phương pháp điện di gel để tách và hiển thị các đoạn DNA (nhuộm EtBr, phóng xạ tự ghi), cách đánh giá kích thước của các đoạn DNA bằng marker và lập bản đồ giới hạn phân tử DNA.
• Gắn các phân tử DNA (Ligation): Vai trò của DNA-ligase trong việc nối các đoạn DNA, hiệu quả của việc gắn các đầu dính so với đầu bằng, và các phương pháp tạo đầu dính từ phân tử DNA đầu bằng (sử dụng linker, adapter, hoặc gắn đuôi homopolymer).
• Vector tạo dòng: Khái niệm vector tạo dòng và giới thiệu các loại vector quan trọng trong E. coli:
  • Vector plasmid: Đặc điểm (DNA vòng, độc lập, chứa gen chọn lọc, có ori), độ lớn và số lượng bản sao. Đi sâu vào pBR322 (ưu điểm: kích thước nhỏ, 2 gen kháng kháng sinh, số lượng bản sao lớn) và nguồn gốc của nó. Giới thiệu pUC8 (ưu điểm: số lượng bản sao lớn, dễ xác định thể tái tổ hợp bằng LacZ’, tập trung vị trí cắt) và pGEM3Z (có promoter để phiên mã DNA tạo dòng in vitro).
  • Vector tạo dòng trên cơ sở thực khuẩn thể M13: Đặc điểm (DNA sợi đơn, phức tạp hơn plasmid), quá trình phát triển các vector M13 (M13mp2, M13mp7) với khả năng tạo dòng và xác định thể tái tổ hợp.
  • Vector tạo dòng là phage λ: Giới thiệu phage λ (DNA mạch thẳng, trình tự cos, chu trình tan/tiềm tan). Các vấn đề khi sử dụng phage λ tự nhiên làm vector (giới hạn độ lớn DNA, nhiều vị trí cắt hạn chế) và cách giải quyết (cắt bỏ vùng đệm “không quan trọng”, chọn lọc tự nhiên). Phân loại vector phage λ thành vector thay thế và vector xen đoạn, với ví dụ cụ thể như Agt10 và λZAPII.